Inovace biochemických programů
2011 - 2013
Inovace biochemických bakalářských programů Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity pro potřeby moderní společnosti
Operační program vzdělávání pro konkurenceschopnost
Prioritní osa: Terciální vzdělávání, výzkum a vývoj     Oblast podpory: Vysokoškolské vzdělávání

Virtuální laboratoř

Elektroforéza v přítomnosti SDS – SDS PAGE

Elektroforéza v přítomnosti SDS – SDS PAGE je jednoduchá, rychlá a reprodukovatelná metoda pro kvalifikovanou charakterizaci a srovnání bílkovin.Tato metoda separuje bílkoviny na základě rozdílné relativní molekulové hmotnosti. SDS se zde váže na bílkovinný řetězec v poměru 1.4 g SDS na 1g bílkoviny, přičemž délka komplexu SDS – bílkovina je úměrná jeho molekulové hmotnosti. Na základě srovnání relativních mobilit neznámé bílkoviny a standardů je pak možné určit její relativní molekulovou hmotnost.

  elektromigrační dráha neznámé bílkoviny
Relativní mobilita (Rf ) = ----------------------------------------------------
  celková délka elektroforézy

Kalibrační závislost Log MW = f (Rf )

sdspage1.png

I. Příprava gelu

A. Sestavení gelového sendviče

Na stojánek položte držák, k jeho vnitřní straně umístěte delší sklo, na ně spacery a pak kratší sklo. Držák stáhněte a upněte ve stojánku.

sdspage2.png

B. Nalévání separačního gelu.

Na elektromagnetickou míchačku dejte kádinku s míchadlem a do ní pipetujte roztoky podle schématu, roztoky nepipetujte ústy !

1.3 ml separačniho pufru pH 8.3
1.3 l roztoku akrylamidu
2.5 ml destilované vody
50 μl 10 % persíranu amonného
5 ul TEMEDu

Promíchejte polymerizační směs zvýšením otáček a nasajte ji do injekční stříkačky. Směs opatrně nastříkněte mezi skla do výše zářezu a převrstvěte n-butanolem. Ponechte polymerovat tak dlouho, až se mezi gelem a vodnou fází vytvoří ostré rozhraní.

sdspage3.png

sdspage4.png

Slijte nezpolymerovanou část, promyjte vodou ze střičky a odsajte přebytek kapaliny filtračním papírem.

C. Nalévání koncentračního gelu

Na elektromagnetickou míchačku dejte kádinku s míchadlem a do ní pipetujte roztoky podle schématu, roztoky nepipetujte ústy !

1.2 ml koncentračního pufru pH
0.7 ml roztoku akrylamidu
3.1 ml destilované vody
50 ul 10 % persíranu amonného
5 ul TEMEDu

Promíchejte polymerizační směs zvýšením otáček a nasajte ji do injekční stříkačky. Mezi skla nastříkněte polymerizační směs a vložte do ní hřebínek. Ponechte polymerovat.

sdspage5.png

Vyjměte hřebínek z gelu a vzorkové jamky vypláchněte destilovanou vodou. Gel vložte do vlhké komůrky.

II. Elektroforéza

A. Sestavení aparatury

Ke vnitřnímu elektrodovému prostoru připevněte gel a prázdný držák s kratším sklem. Takto sestavený vnitřní elektrodový prostor vložte do nádobky a naplňte elektrodovým pufrem.

Elektroforetická aparatura Mini Protean II

sdspage6.png

B. Nanesení vzorku.

Do vzorkových jamek naneste pomocí stříkačky 20 ml vzorku, tak abyste je podvrstvili pod elektrodový pufr. Mezi jednotlivými vzorky stříkačku vypláchněte destilovanou vodou.

sdspage7.png

C. Vlastní elektroforéza

Elektroforetickou aparaturu uzavřete víkem a připojte ji ke zdroji stejnosměrného napětí. Na zdroji nastavte konstantní napětí 125 V a po zapnutí ponechte elektroforézu probíhat tak dlouho, až zóna bromfenolové modři doputuje ke spodnímu okraji gelu.

D. Ukončení elektroforézy

Vypněte zdroj, otevřete elektroforetickou aparaturu, vyjměte z ní vnitřní elektrodový prostor, a slijte elektrodový pufr. Uvolněte z vnitřního elektrodového prostoru držák s gelem a opatrným zapáčením od sebe uvolněte skla. Z gelu odstraňte koncentrační část a zbytek přeneste do fixačního roztoku.

III. Detekce bílkovin stříbrem

krok roztoky čas
1. 60 ml 50 % acetonu, 1.5 ml 50 % TCA , 25 µl 37 % HCHO 5 min
2. opláchněte 3x deionizovanou vodou 3 x 5 s
3. promytí deionizovanou vodou 5 min
4. opláchněte 3x deionizovanou vodou 3 x 5 s
5. 60 ml 50 % acetonu 5 min
6. 100 µl 10 % Na2S2O3 v 60 ml deionizované vody 1 min
7. opláchněte 3x deionizovanou vodou 3 x 5 s
8. 0.8 ml 20 % AgNO3 , 0.6 ml 37 % HCHO , 60 ml H2O 8 min
9. opláchněte 2x deionizovanou vodou 2 x 5 s
10. 60 ml 2 % Na2CO3 , 25 µl 37 % HCHO , 25 µl 10 % Na2S2O3 10-20 s
11. 1 % HAc 30 s
12. promytí deionizovanou vodou 10 s

IV. Sušení gelu

Gel přeneste do 1 % roztoku glycerínu a ponechte jej zde 15 minut ekvilibrovat. Do stejného roztoku vložte na 5 minut celofánovou folii, gel a zalijte jej trochou glycerínového roztoku. Gel překryjte celofánovou folií a pomocí skleněné tyčinky vytlačte gel gumovou membránou a vrchním víkem. Zapněte sušičku a ponechte gel sušit asi 2 hodiny při 80 0 C.

!!!!! Důležité upozornění !!!!!

Monomery používané pro přípravu gelu jsou neurotoxiny a proto :

  • roztoky nikdy nepipetujte ústy
  • pracujte v rukavicích
  • pracujte v digestoři
Evropský sociální fondEvropská unieMinisterstvo školství, mládeže a tělovýchovyOperační program Vzdělávání pro konkurenceschopnostMasarykova univerzita
INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.