Inovace biochemických programů
2011 - 2013
Inovace biochemických bakalářských programů Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity pro potřeby moderní společnosti
Operační program vzdělávání pro konkurenceschopnost
Prioritní osa: Terciální vzdělávání, výzkum a vývoj     Oblast podpory: Vysokoškolské vzdělávání

Virtuální laboratoř

Využití chelatační afinitní chromatografie (IMAC) při studiu a purifikaci biomolekul

Oldřich Janiczek, Přírodovědecká fakulta MU, Brno

Obrovský rozvoj na poli proteinové chemie v posledních padesáti letech byl podmíněn vývojem velmi efektivních technik proteinové separace a analýzy. Převážná většina z nich je založena na rozdílné hmotnosti či náboji separovaných biomolekul. V posledních dvaceti letech však nabývá na významu skupina metod založených na specifické interakci mezi biomolekulou a ligandem. V případě, že je ligand imobilizován na vhodné stacionární fázi a provádíme chromatografii, hovoříme o chromatografii afinitní. A právě jednou z posledních zavedených chromatografických technik je chelatační afinitní chromatografie, založená na vzájemné interakci mezi biopolymerem v roztoku a kovovými ionty vázanými na pevné fázi, obvykle hydrofilním polymeru. Porath a kol. publikovali v polovině sedmdesátých let koncept popisující princip této metody (Porath 1975) a nazvali ji „Metal chelate chromatography“. Název byl později pozměněn (Porath 1983) na „Immobilized metal ion affinity chromatography“ (IMAC). Vytvoření českého ekvivalentu názvu metody ponechávám na čtenáři; v tomto textu je používán název Chelatační afinitní chromatografie popř. zkratka IMAC.

Chelatační sorbent

Historie chelatujících sorbentů je poměrně krátká. První práce v tomto směru pocházejí ze čtyřicátých let. Od té doby se tato oblast polymerní chemie velice rychle rozvíjí (viz. přehledné práce Blasius 1963, Schmucker 1977, Mjaslojedova 1971, Kahovec 1981). Chelatující sorbent lze v podstatě připravit třemi způsoby.

1/ polykondenzací - chelatační ligand je obsažen již v některém z monomerů nebo vzniká až polykondenzací;
2/ polymerací vinylového monomeru obsahujícího chelatační ligand
3/ zavedením chelatačního ligandu do polymerního nosiče

Polykondenzační postup je už v současné době překonán (produkty jsou často málo stálé, lze obtížně regulovat stupeň zesítění a za podmínek polykondenzace může být často napaden samotný chelatační ligand).
Polymerační způsob naráží na problém přípravy a čištění speciálních monomerů.
Poslední, třetí způsob se zdá být nejvhodnější. I tato nejpoužívanější metoda má však své nevýhody. Při imobilizaci ligandu může totiž docházet k vedlejším reakcím a mohou vznikat chemicky rozdílná chelatující seskupení.
Nejpoužívanějším polymerním nosičem pro navázání chelatačního ligandu je stejně jako u většiny ostatních afinitních chromatografických technik agarosa. Jsou však využívány i další typy polymerních nosičů jako je sepharosa, supherosa, trisakrylové gely (Boschetti 1983, Moroux 1985) atd. Za zmínku stojí i sorbenty pro vysokotlakou chelatační chromatografii (HP-IMAC), kde je kladen důraz na vysokou mechanickou stabilitu. K tomu účelu byly připraveny nosiče na bázi silikátu (Fanou-Ayi 1983, El-Rassi 1986, Figueroa 1986) popř. na bázi hydrofilních pryskyřic (Kato 1986, Nakagawa 1988, Yip 1989, Belew 1987).

Chelatační ligand

Nejpoužívanějším ligandem pro imobilizaci na polymerní nosič je iminodiacetát (IDA). V poslední době je však tendence nahrazení IDA ligandem vytvářejícím stabilnější komplexy s kovy. Na sorbentech pro HP-IMAC bylo totiž pozorováno postupné uvolňování kovových iontů ze sorbentu, což má v mnoha případech negativní vliv na separované proteiny. Mezi chelatační ligandy vytvářející stabilnější komplexy s kovy můžeme zařadit karboxymetylaspartát (CM-ASP), tris(karboxymetyl) etylendiamín (TED), N-(2-pyridylmetyl)glycin. Všechny tyto chelatační ligandy byly vhodným způsobem navázány na nosič a následně testovány vlastnosti takto vzniklého chelatačního sorbentu (Monjon 1987, Porath 1988).

komplex chelatační sorbent-kov

Kovové ionty lze rozdělit do tří kategorií podle jejich reaktivity vůči nukleofilům na tzv. „tvrdé“, „středně tvrdé“ a „měkké“ (Pearson 1963, Pearson 1973, Ho 1977). „Tvrdé“ kovy patří do skupiny silných Lewisových kyselin neboli skupiny silných akceptorů elektronů. Toto rozdělení nepochybně usnadňuje volbu vhodných kovů využitelných pro IMAC. Hranice mezi jednotlivými kategoriemi jsou však dost neostré a to hlavně u kovů zařaditelných do skupiny středně silných a slabých Lewisových kyselin, což vede k tomu, že bývají rozlišovány pouze dvě kategorie kovů: „tvrdé“ a „měkké“. Do kategorie „tvrdých kovů“ lze zařadit ionty Fe3+, Sc3+, Th4+, Al3+, Ga3+, In3+. Tyto ionty preferují interakci s atomem kyslíku ligandu. Do kategorie „měkkých kovů“ bývají zařazovány ionty Cu2+, Zn2+, Ni2+, Co2+, Fe2+, Mn2+, Mg2+.
Irving a Williams porovnali konstanty stability komplexů těchto kovů s ligandy obsahujícími kyslík nebo dusík jako donory elektronů (Irving 1948):

Zn2+ < Cu2+ > Ni2+ > Co2+ > Fe2+ > Mn2+ > Mg2+

Právě ionty „měkkých“ kovů (hlavně Cu2+, Zn2+ a Ni2+) bývají velice často používány při IMAC.
Při výběru vhodného ligandu a kovu se snažíme, aby komplex ligand-kov byl co nejstabilnější, na druhé straně však ne tak stabilní, abychom nebyli schopni za určitých podmínek kov z komplexu uvolnit. Navíc se dá formulovat obecné pravidlo, Že čím silnější je interakce mezi kovem a ligandem, tím slabší je pak interakce mezi komplexem ligand-kov a peptidem (proteinem).

komplex1.jpg

komplex chelatační sorbent-kov-aminokyselina(peptid,protein)

Porath a kol. ve své úvodní práci (Porath 1975) dali do úzkého vztahu chování proteinů při IMAC a množství imidazolových a thiolových skupin na povrchu interagujícího proteinu. Také další práce (Porath 1983a, Coulet 1981) dokazují přítomnost specifické interakce mezi kovem a proteinem, závislé na pH. Tato interakce vynikne po potlačení elektrostatické a hydrofobní interakce, které také mohou mít vliv na chování proteinu při IMAC. Vliv elektrostatické interakce se dá odstranit buď použitím vysoké iontové síly v médiu (v převážné většině prací se používá NaCl v koncentraci od 0.5 do 1 mol/l) nebo použitím elektroneutrálních komplexů chelatační sorbent-kov. Vliv interakce hydrofobní je méně zřetelný a prakticky úplně se dá potlačit volbou vhodného chelatačního sorbentu.
Samotná interakce mezi kovem a proteinem je způsobena vznikem koordinační vazby mezi akceptorem elektronů - kovem a donorem elektronů - aminokyselinovým zbytkem s vysokou elektronovou hustotou (His, Cys, Trp) orientovaném na povrchu proteinu (Coulet 1981). Pro tyto ligandy je charakteristická schopnost stabilizovat nízké oxidační stavy (Cotton 1973).
Na proces interakce je také možno nahlížet jako na speciální typ Ligand exchange chromatography (LEC), kde jsou slabě navázané „anti-ligandy“ vody v komplexu chelatační sorbent-kov nahrazeny „anti-ligandy“ nukleofilnějšími. „Anti-ligandy“ u proteinů a peptidů lze rozdělit do dvou skupin. První skupinu tvoří aminokyselinové zbytky obsahující imidazol, thiol nebo indol na povrchu proteinu (peptidu) a druhým reaktivním centrem je N- terminální aminokyselina (důležitý je hlavně aminodusík).
Aminokyseliny vytvářejí odlišné komplexy, které mají větší stabilitu než komplexy peptidů nebo proteinů (jejich aminoskupiny jsou silnější base a jejich karboxylové skupiny jsou lepšími donory elektronů než karbonylové skupiny peptidů).

komplex2.jpg

Aplikace IMAC

Využití IMAC při purifikaci

Největší využití našla IMAC, hlavně v počátcích svého vývoje, při purifikaci proteinů krevní plazmy. Tímto způsobem byl na kolonách s chelatačním sorbentem nasyceným zinkem purifikován makroglobulin (Sottrup-Jensen 1980, Borth 1981, Hudson 1982, Imber 1982), inhibitor proteinázy (Sottrup-Jensen 1980, Kurecki 1979), HS glykoprotein (Lebreton 1977, Lebreton 1979), aktivátory plazminogenu (Rijken 1979, Rijken 1981). Andersson použil při frakcionaci lidského séra Sepharosu 6B obsahující ligandy IDA resp. tris(karboxymetyl)etylendiamín s navázanými ionty Zn2+ a Cd2+. Lonnerdal a kol. využili IMAC při purifikaci laktoferinu z lidského mléka na chelatačních sorbentech nasycených mědí. Výtěžek laktoferrinu byl prakticky 100% a navíc biologické vlastnosti laktoferrinu (inhibice bakteriálního růstu) zůstaly zachovány, což svědčí o tom, že nedochází k poškození proteinu. Pro dokumentování širokého spektra použití IMAC lze uvést izolaci interferonu (Knight 1978). Na chelatačních sorbentech nasycených zinkem, mědí, kobaltem nebo niklem byly izolovány a charakterizovány interferony z mnoha zdrojů (Egly 1977, Bollin 1978, Chadha 1979, Ferreira 1981, Berg 1980, Berg 1981, Yonehara 1981). Mimo praktické využití při purifikaci dává afinita interferonů ke kovovým chelátům možnost porovnání jejich strukturálních podobností, které se odrážejí v orientaci některých aminokyselinových zbytků na povrchu těchto proteinů (Sulkowski 1982). Smith a kol. (Smith 1987, Smith 1988) využili s úspěchem faktu, že adsorpce proteinu může být silně zvýrazněna, jestliže jsou zbytky histidinu lokalizovány blízko N-terminální aminokyseliny peptidického řetězce, k zavedení techniky pro rychlou izolaci rekombinantních proteinů.
Samostatnou skupinu aplikací tvoří separace proteinů na chelatačních sorbentech nasycených „tvrdými“ kovy (Fe3+, Al3+, Ga3+, In3+, Th3+). Jak již bylo uvedeno, tvrdé kovy preferují při interakci karboxylové a fosfátové skupiny. Byla popsána chromatografie sérových proteinů (Ramadan 1985a, Ramadan 1985b), lysozymu, cytochromu c, avidinu, hovězí pankreatické RNazy, myoglobinu, ovalbuminu (Ramadan 1985c) a specifická sorpce fosfoproteinů (Andersson 1986). Ve všech případech byl chelatační sorbent nasycen Fe3+.

Další aplikace IMAC

Separovaná makromolekula Použitý
imobilizovaný
kovový iont
odkaz
Nukleosidbisfosfatasa z krysích jater Zn2+ Ohkubo 1980
Granuloproteiny granulocytů Cu2+ Tores 1979
Lektin semen Dolichos biflorus Zn2+ Borrebaeck 1981
Gastrointestinální polypeptidy Zn2+ Conlon 1976
Inhibitor trypsinu z lidského séra Zn2+ Salier 1980
Inhibitor thiol proteinas Cu2+ Ryley 1979
nehistonové proteiny Cu2+ Kikuchi 1981
nukleotidy Cu2+ Hubert 1981
aminoacylovaná t-RNA Cu2+ Gozdzicka-Jozefiak 1977
NADH nitrátreduktasa Zn2+ Redinbaugh 1983
cyt P-450 Ni2+ Kastner 1991
katalasa Cu2+ Miyata-Asano 1986
superoxid dismutasa Cu2+ Weselake 1986
Albumin (BSA) Cu2+, Zn2+ Hansson 1981
lysozym Cu2+ Torres 1979
Ovotransferrin Cu2+ Al-Mashikhi 1987
Perforin a granzymy lymfocytů Co2+ Winkler 1996
karboxypeptidasa B Zn2+ Hortin 1989

Purifikace rekombinantních proteinů pomocí His tagu

Velice důležitou aplikací IMAC se v posledních letech stává jednokroková purifikace rekombinantních proteinů obsahujících navíc takzvanou histidinovou kotvu. Interakce chelatačního nosiče se separovaným proteinem je pak natolik silná, že můžeme podmínky separace nastavit tak, aby v ideálním případě interagoval pouze námi separovaný protein. Imobilizovaným kovovým iontem bývá v tomto případě většinou Ni2+.

Tandemová chromatografie

Chelatační chromatografie se zdá být i velice vhodnou metodou pro tzv. tandemové uspořádání (při chromatografii je za sebou propojeno několik kolon naplněných chelatačním sorbentem). Jednotlivé sorbenty se liší použitým kovem popřípadě na nosič navázaným ligandem. Je zde tedy velice mnoho kombinací, které dovolují vytvořit optimální podmínky pro separaci požadovaného proteinu. Tato idea byla testována například na modelovém vzorku lidských sérových proteinů (Porath 1986, Porath 1987a, Porath 1987b). V tomto případě se na první kolonce naplněné chelatačním sorbentem s ligandem TED a nasyceném Zn2+ zachytí při pH 7.0 hlavně makroglobulin a hemopexin, zatímco převážná většina bílkovin je zachycena na dalších sorbentech (např Cu-IDA).

Renaturace (refolding)

Jevem, provázejícím expresi proteinů, bývá tvorba nerozpustných útvarů, takzvaných inkluzních tělísek v bakteriální cytoplasmě. Tyto nekorektní konformery rekombinantního proteinu mohou vznikat z mnoha různých důvodů (toxicita rekombinantního proteinu pro bakteriální metabolismus, nepřítomnost vhodného chaperonu atd.). Inkluzní tělíska se dají rozpustit vysokými koncentracemi močoviny nebo guanidinium chloridu a protože IMAC se dá provádět i za denaturačních podmínek, je metoda použitelná i při purifikaci rekombinantního proteinu (s His tagem), který je za nativních podmínek součástí inkluzních tělísek. Zároveň lze vlastní purifikaci využít i pro renaturaci proteinu. V tomto případě je renaturace navázaného proteinu prováděna postupným snižováním koncentrace denaturačního činidla v mobilní fázi. Pokud je tento renaturační protokol dostatečně úspěšný je pak pro nás tvorba inkluzních tělísek spíše výhodou, protože zastoupení rekombinantního proteinu bývá v inkluzních tělíscích velice významná. Navíc jsou inkluzní tělíska snadno oddělitelná od bakteriálního cytosolu.

Příklad renaturačního protokolu a průběhu separace

Využití IMAC při studiu povrchu biomolekul

Jak bylo naznačeno v dřívějším textu největší vliv na chování biomolekul (proteinů) při IMAC mají histidinové zbytky orientované na povrchu biomolekuly (v menší míře pak zbytky cysteinu a tryptofanu). V posledních několika letech se dokonce objevují práce (Muszynska 1986, Hemdan 1989, Sulkowski 1985), ve kterých autoři dávají do úzkého vztahu počet histidinových zbytků na povrchu biomolekuly a sílu interakce mezi biomolekulou a chelatačním sorbentem. Z výsledků IMAC se snaží získat informace nejenom o počtu histidinových zbytků, ale i o „mikrookolí“ histidinu zapojeného do interakce, popřípadě spojení vlivu více histidinových zbytků orientovaných dostatečně blízko sebe.

K posouzení těchto interakcí slouží několik základních přístupů:

  • IMAC na chelatačních sorbentech nasycených měďnatými ionty. Chelatační sorbent se ekvilibruje pufrem o pH 7.0 a po nanesení vzorku a promytí startovním pufrem se postupně snižuje pH až na 4.0. Látky nezachycené na chelatačním sorbentu při pH 7.0 by pak neměly obsahovat histidin, schopný chelatační interakce, látky eluované při pH 6.0 histidin jeden, při pH 5.0 popřípadě 4.0 histidiny dva
  • Chelatační sorbent nasycený měďnatými ionty je ekvilibrován pufrem o pH 7.0 s 1 mmol/l imidazolem a po nanesení vzorku se postupně zvyšuje koncentrace imidazolu v mobilní fázi až na 15 mmol./l. Látky nezachycené (1 mmol/l imidazol) mohou obsahovat jeden histidinový zbytek. Látky s dvěma histidinovými zbytky jsou eluovány 7 - 8 mmol/l imidazolem
  • Chelatační sorbent je nasycen nikelnatými ionty a po nanesení vzorku jsou látky izokraticky eluovány startovním pufrem o pH 7.0. V mrtvém objemu kolony vytékají látky obsahující jeden nebo neobsahující žádný histidinový zbytek. V desetinásobku mrtvého objemu eluují látky se dvěma histidinovými zbytky. V šedesátinásobku mrtvého objemu pak látky se čtyřmi popřípadě pěti histidinovými zbytky

Nabízí se i možnost „odfiltrování“ interagujících aminokyselinových zbytků specifickou modifikací. Tato metoda by mohla být zvlášť vhodná při studiu vlivu jiných aminokyselinových zbytků, než je histidin. Vliv těchto aminokyselinových zbytků je v přítomnosti histidinu malý. Bylo popsáno chování ovotransferrinu při IMAC po modifikaci histidinových zbytků diethylpyrokarbonátem (Al-Mashikhi 1987). V tomto případě se modifikovaný ovotransferrin na chelatačním sorbentu nasyceném mědí vůbec nezachytil. E. Sulkowski (Sulkowski 1987) sledoval chování chymotrypsinogenu A, chymotrypsinu A a chymotrypsinu při IMAC na chelatačním sorbentu nasyceném mědí. Zjistil veliké rozdíly v eluci těchto látek po přidání diizopropylfosfofluoridátu. Tyto změny vysvětlil změnou „mikrookolí“ interagujícího histidinu.

Příklady interakce kov-protein

  1. Apoferritin
    Apoferritin je intracelulární protein, který váže pro buňku toxické Fe3+ ionty a zároveň slouží jako rezervní zdroj železa pro syntézu cytochromů a dalších Fe-obsahujících biomolekul. Molekula apoferritinu je schopna vyvázat až 4500 atomů železa (Theil 1987, Chasteen 1985). Zdá se tedy velice pravděpodobné, že alespoň část z vazebných míst pro železo je umístěna blízko povrchu nebo přímo na povrchu apoferritinu. Chelatační chromatografie na sorbentech nasycených Fe3+ tedy může být vhodnou metodou nejenom pro purifikaci apoferritinu, ale i pro studium aktivního místa. R. F. Boyer a kol. (Boyer 1990) zjistili, že vazba do tohoto místa je závislá na pH - nejsilnější interakce byla pozorována při pH 4.0. Tato skutečnost naznačuje, že na interakci s Fe3+ se podílí hlavně ligandy s kyslíkovým atomem. V aktivních místech byla prokázána přítomnost zbytků kyselin asparagové a glutamové (Yang 1987, Sayers 1983, Wardeska 1986). Komplex apoferritin : Fe3+ je stabilní v přítomnosti 1 mol/l NaCl. V případě použití silného chelatačního činidla, jako je oxalát, citrát nebo EDTA je vazba chelatační ligand : Fe3+ přerušena a dochází k eluci komplexu apoferritin : Fe3+. K eluci apoferritinu bez Fe3+ dochází pouze zvýšením pH nebo vlivem fosfátu popřípadě fosfoserinu (Boyer 1990).
    Závěry:
    A/ Větší afinita apoferritinu k chelatačnímu sorbentu
    nasycenému Fe3+ při nižších pH indikuje důležitost iontových interakcí (Belew 1987, Ramadan 1985c)
    B/ Stabilita komplexu apoferritin : Fe3+ v 1 mol/l NaCl signalizuje, že mimo iontových interakcí dochází i ke vzniku koordinačně-kovalentních vazeb (Boyer 1990)
     
  2. Albumin (BSA)
    Albumin je velice zajímavá biomolekula, jejíž funkcí v organismu je mimo jiné i transport širokého spektra látek (Feihke 1979, Gambhir 1975, Jacobson 1969, Wilting 1981, Nakano 1982). Vazba Cu2+ na BSA byla studována v mnoha laboratořích (Kure 1984, Nakano 1982, Mohanakrishnan 1982, Klotz 1948, Naik 1975, Katz 1980). Při pH 7.4 byly u BSA nalezeny tři místa schopné více či méně silně vázat Cu2+ (Zgirski 1990). Vazebné místo 1 je lokalizováno na N-terminálním konci proteinu. Obsahuje tedy aminodusík N-terminální aminokyseliny (Asp), imidazolový dusík histidinového zbytku v pozici 3, dva dusíky peptidické vazby (Thr{2}, His{3}) a kyslík karboxylu (Asp) (Schearer 1967, Sarkar 1982, Laussac 1984). Asociační konstanta (Ka) pro komplex Cu2+ : vazebné místo 1 se pohybuje v rozsahu 1.1 x 1012 - 1.6 x 1013 mol-1 (Giroux 1981, Syvertsen 1986). Cu2+ není odstranitelný chelatačně ani při velmi nízkých průtocích (3 ml/hod) na chelatačních sorbentech nenasycených kovem. Vazebné místo 2. Struktura vazebného místa 2 nebyla dosud dostatečně prostudována. Cu2+ se do tohoto místa váže slaběji a je neodstranitelný chelatačně pouze při vysokých průtocích (40 ml/hod). Asociační konstanta se v tomto případě pohybuje kolem 5.2 x 106 mol-1 (Zgirski 1990, Schearer 1967, Syvertsen 1986). Při pH 7.4 je BSA schopen vyvázat další tři ionty Cu2+. Asociační konstanta je v tomto případě ještě nižší a pohybuje se kolem hodnoty 1.6 x 105 mol-1. Tyto atomy mědi jsou sice neoddialyzovatelné, ale odstranitelné chelatačně i při velmi vysokých průtocích (Zgirski 1990). Je však nutné zdůraznit, že množství vazebných míst pro Cu2+ na BSA je značně závislé na pH. Při pH 4.8 - 5.3 byla nalezena 1 - 3 místa s Ka 0.8 - 30 x 105 mol-1 a 3 - 16 míst s Ka 0.5 - 2 x 104 mol-1 (86-90). Při pH 8 - 10 bylo nalezeno pouze jedno vazebné místo s vysokou afinitou k Cu2+ (Kolthoff 1957).

Literatura

  1. J. Porath, J. Carlsson, I. Olin, G. Belfrage, Nature (London), 258, 598 (1975).
  2. J. Porath, I. Olin, Biochemistry, 22, 1621 (1983).
  3. E. Blasius, B. Brozio, H. A. Flaschka, A. J. Barnard (eds.), Chelates in Analytical Chemistry, 1. díl, M. Dekker, New York 1963.
  4. G. Schmucker, v knize: Encyklopedia of Polymer Science and Technology, Supplement, 2. díl, str.197. Interscience, New York, London, Sydney, Toronto 1977.
  5. G. V. Mjaslojedova, O. P. Jenisejeva, S. B. Savin, Žur. Anal. Chim., 26, 2172 (1971).
  6. J. Kahovec, Chem. listy, 75, 398 (1981).
  7. E. Boschetti, P. Girot, O. Pepin, Sci. Tools, 30, 27 (1983).
  8. Y. Moroux, E. Boschetti, J. M. Egly, Sci. Tools, 32, 1 (1985).
  9. L. Fanou-Ayi, M. Vijalakshmi, Ann. NY. Acad. Sci, 413, 300 (1983).
  10. Z. El-Rassi, C. Horvath, J. Chromatog., 359, 241 (1986).
  11. A. Figueroa, C. Corradini, B. Feibush, B. Karger, J. Chromatogr., 371, 335 (1986).
  12. Y. Kato, K. Nakamura, T. Hashimoto, J. Chromatogr., 354 511 (1986).
  13. Y. Nakagawa, T. T. Yip, M. Belew, J. Porath, Anal. Biochem., 168, 75 (1988).
  14. T. T. Yip, Y. Nakagawa, J. Porath, Anal. Biochem., 183 159 (1989).
  15. M. Belew, T. T. Yip, L. Andersson, R. Ehrstrom, Anal. Biochem., 164, 457 (1987).
  16. B. Monjon, J. Solms, Anal. Biochem., 160, 88 (1987).
  17. J. Porath, Trends in Anal. Chem., 7, 254 (1988).
  18. R. G. Pearson, J. Am. Chem. Soc., 85, 3533 (1963).
  19. R. G. Pearson, Hard and soft acids and bases Dowden, Hutchinson, Ross, Stroudsberg, 1973.
  20. T. L. Ho, Hard and soft acids and bases, Principles in Organic chemistry, Acadedic Press, New York, 1977.
  21. H. Irving, R.J.P. Williams, Nature (London), 162, 746 (1948).
  22. J. Porath, M. Belew, v knize: Affinity chromatography and biological recognition, I. M. Chaiken, M. Wilchek, I. Parikh, Eds., str. 173. Academic Press, New York, 1983.
  23. P. R. Coulet, J. Carlsson, J. Porath, Biotechnol. Bioeng. 23, 663 (1981).
  24. F. A. Cotton, G. Wilkinson, v knize: Anorganická chemie, Academia, str. 691. Praha, 1973.
  25. L. Sottrup-Jensen, T. E. Petersen, S. Magnusson, FEBS Lett., 121, 275 (1980).
  26. W. Borth, E. J. Menzel, M. Salzer, C. Steffen, Clin. Chim. Acta, 117, 219 (1981).
  27. N. W. Hudson, P. H. Koo, Biochim. Biophys. Acta, 704 290 (1982).
  28. M. J. Imber, S. V. Pizzo, W. J. Johnson, D. O. Adams, J. Biol. Chem., 257, 5129 (1982).
  29. T. Kurecki, L. E. Kress, M. Laskowski, Anal. Biochem. 99, 415 (1979).
  30. J. P. Lebreton, FEBS Lett., 80, 351 (1977).
  31. J. P. Lebreton, F. Joisel, J. P. Rault, J. Clin. Invest. 64, 1118 (1979).
  32. D. C. Rijken, G. Wijngaards, M. Z. DeJong, J. Welbergen Biochim. Biophys. Acta, 580, 140 (1979).
  33. D. C. Rijken, D. Collen, J. Biol. Chem., 256, 7035 (1981).
  34. L. Andersson, J. Chromatogr., 315, 167 (1984).
  35. B. Lonnerdal, J. Carlsson, J. Porath, FEBS Lett., 75, 89 (1977).
  36. E. Knight, J. Pharmac. Ther. A., 2, 439 (1978).
  37. V. G. Egly, A. Billiau, P. DeSomer, J. Biol. Chem., 252 5934 (1977).
  38. E. Bollin, E. Sulkovski, Arch. Virol., 58, 149 (1978).
  39. K. C. Chadha, P. M. Grob, A. J. Mikulski, L. R. Davis, E. Sulkowski, J. Gen. Virol., 43, 701 (1979).
  40. P. C. P. Ferreira, M. Paucher, R. R. Golgher, Arch. Virol., 68, 27 (1981).
  41. K. Berg, I. Heron, J. Gen. Virol.(London), 50, 441 (1981).
  42. K. Berg, I. Heron, Scand. J. Immunol., 11, 489 (1980).
  43. S. Yonehara, Y. Yanase, T. Sano, M. Imai, S. Nakasawa, H. Mori, J. Biol. Chem., 256, 3770 (1981).
  44. E. Sulkowski, K. Vastola a D. Oleszek, v knize: Affinity Chromatography and Related Techniqes, T. C. J. Gribnau, J. Visser, R. J. F. Nivard, Eds., str. 313. Veldhoven, The Netherlands, 1982.
  45. M. C. Smith, T. C. Furman, C. Pidgeon, Inorg. Chem., 26 1965 (1987).
  46. M. C. Smith, T. C. Furman, T. D. Ingolia, C. Pidgeon, J. Biol. Chem., 263, 7211 (1988).
  47. N. Ramadan, J. Porath, J. Chromatogr., 321, 81 (1985).
  48. N. Ramadan, J. Porath, J. Chromatogr., 321, 105 (1985).
  49. N. Ramadan, J. Porath, J. Chromatogr., 321, 93 (1985).
  50. L. Andersson, J. Porath, Anal. Biochem., 154, 250 (1986).
  51. I. Ohkubo, T. Kondo, N. Taniguchi, Biochim. Biophys. Acta, 616, 89 (1980).
  52. A. R. Tores, E. A. Peterson, W. H. Evans, M. G. Mage, S. M. Wilson, Biochim. Biophys. Acta, 576, 385 (1979).
  53. C. A. K. Borrebaeck, B. Lonnerdal, M. E. Etzler, FEBS Lett., 130, 194 (1981).
  54. M. Conlon, R. F. Murphy, Biochem. Soc. Trans., 4, 865 (1976).
  55. J. P. Salier, J. P. Martin, P. Lambin, H. McPhee, K. Hochstrasser, Anal. Biochem., 109, 273 (1980).
  56. H. C. Ryley, Biochem. Biophys. Res. Commun., 89, 871 (1979).
  57. H. Kikuchi, M. Watanabe, Anal. Biochem., 115, 109 (1981).
  58. P. Hubert, J. Porath, J. Chromatogr., 206 (1981) 164
  59. A. J. Gozdzicka-Jozefiak, D. Augustyniak, J. Chromatogr., 131, 91 (1977).
  60. M. G. Redinbaugh, W. H. Campbell, Plant Physiol., 71, 205 (1983).
  61. M. Kastner, D. Neubert, J. Chromatogr., 587, 43 (1991)
  62. M. Miyata-Asano, K. Ito, H. Ikeda, S. Sekiguchi, K. Arai, N. Taniguchi, J. Chromatogr., 370, 501 (1986).
  63. R. J. Weselake, S. L. Chesney, A. Petkau, A. D. Friesen, Anal. Biochem., 155, 193 (1986).
  64. H. Hansson, L. Kagedal, Adsorption and desorption of proteins in metal chelate affinity chromatography : Purification of albumin. J. Chromatogr., 215, 333 - 339 (1981).
  65. A. R. Torres, E. A. Peterson, W. H. Evans, M. G. Mage, S. M. Wilson, Biochim. Biophys. Acta, 576, 385 (1979)
  66. S. Al-Mashikhi, S. Nakai, Agric Biol. Chem., 51, 2881 (1987).
  67. U. Winkler, T.M. Pickett, D. Hudig, Fractionation of perforin and granzymes by immobilized metal affinity chromatography, Journal of Imunological Methods, 191, 11 (1996).
  68. G. L. Hortin, B. L. Gibson, Purification of carboxypeptidase B by zinc chelate chromatography, Prep. Biochem., 19, 49 (1989).
  69. G. Muszynska, L Andersson, J. Porath, Biochemistry, 25 6856 (1986).
  70. E. S. Hemdan, Y. Zhao, E. Sulkowski, J. Porath, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1811 (1989).
  71. E. Sulkowski, Trends Biotechnol., 3, 1 (1985).
  72. E. Sulkowski, v knize: Burgess R. ed. Protein purification: micro to macro, Burgess R. ed., str. 149. New York, A. R. Liss, 1987.
  73. E. C. Theil, Annu. Rev. Biochem., 56, 289 (1987).
  74. N. D. Chasteen, B. C. Antanaitis, P. Aisen, J. Biol. Chem.,260, 2926 (1985).
  75. R. F. Boyer, S. M. Generous, T. J. Nieuwenhuis, R. A. Ettinger, Biotechnol. Appl. Biochem., 12, 79 (1990).
  76. C. Yang, A. Meagher, B. H. Huynh, D. E. Sayers, E. C. Theil, Biochemistry, 26, 497 (1987).
  77. D. E. Sayers, E. C. Theil, F. J. Rennick, J. Biol. Chem. 258, 14076 (1983).
  78. J. G. Wardeska, B. Viglione, N. D. Chasteen, J. Biol. Chem., 261, 6677 (1986).
  79. N. D. Chasteen, E. C. Theil, J. Biol. Chem., 257, 7672 (1982).
  80. A. Treffry, P. M. Harrison, J. Inorg. Biochem., 21, 9 (1984).
  81. K. J. Feihke, W. E. Muller, U. Wollert, Biochim. Biophys. Acta, 557, 346 (1979).
  82. K. K. Gambhir, R. H. Menamy, F. Watson, J. Biol. Chem. 250, 6711 (1975).
  83. J. Jacobson, FEBS Lett., 5, 112 (1969).
  84. J. Wilting, W. F. Van der Giesen, L. H. M. Janssen, Bioch. Pharmacol., 10, 1025 (1981).
  85. N. I. Nakano, Y. Shimamori, S. Yamaguchi, J. Chromatogr. 237, 225 (1982).
  86. P. Mohanakrishnan, C. F. Chignell, J. Pharm. Sci., 71 1180 (1982).
  87. N. Kure, H. Nakatsuji, T. Sano, T. Yasunaga, Bull. Chem. Soc. Jpn., 57, 2712 (1984).
  88. I. M. Klotz, H. G. Curme, J. Am. Chem. Soc., 70, 939 (1948).
  89. D. V. Naik, C. F. Jewell, S. G. Schulman, J. Pharm. Sci., 64, 1243 (1975).
  90. S. Katz, R. G. Shinaberry, E. Heck, W. Squire, Biochemistry, 19, 3805 (1980).
  91. A. Zgirski, E. Frieden, J. Inorg. Biochem., 39, 137 (1990).
  92. W. T. Schearer, R. A. Bradshaw, F. R. N. Gurd, J. Biol. Chem., 242, 5451 (1967).
  93. B. Sarkar, J. Indian Chem. Soc., 59, 1403 (1982).
  94. J. P. Laussac, B. Sarkar, Characterization of the copper(II)- and nickel(II)-transport site of human serum albumin. Studies of copper(II)- and nickel(II) binding to peptide 1-24 of human serum albumin by 13C and 1H NMR spectroscopy. Biochemistry, 23, 2832-2838 (1984).
  95. E. Giroux, J. Schoun, J. Inorg. Biochem., 14, 359 (1981).
  96. Ch. Syvertsen, R. Gaustad, K. Schoeder, T. Ljones, J. Inorg. Biochem., 26, 63 (1986).
  97. I. M. Kolthoff, B. R. Willeford, J. Am. Chem. Soc., 79 2656 (1957).
  98. J. Porath, J. Chromatogr., 376, 331 (1986).
  99. J. Porath, Biopolymers, 26, 193 (1987).
  100. J. Porath, Biotechnol. Progr., 3, 14 (1987).
Evropský sociální fondEvropská unieMinisterstvo školství, mládeže a tělovýchovyOperační program Vzdělávání pro konkurenceschopnostMasarykova univerzita
INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.